La sua visita offre molti capolavori: oltre ai trittici di Lorenzo Monaco e alla Maestà di Filippo Lippi, vi si trovano il fonte battesimale di Bernardo Rossellino, i due Santi del Pontormo, l'Annunciazione di Bernardo Rossellino e un repertorio di terracotte robbiane. A Francesco e Raffaello Botticini è dedicata un'intera sala, vicino a quella dove è collocata la tavola con L'Incredulità di San Tommaso di Jacopo da Empoli.
Una delle testimonianze più significative è il Cristo in pietà di Masolino da Panicale, diventato simbolo ed ispirazione anche per l'artista newyorkese Bill Viola, esponente storico della videoarte contemporanea.
Terminata la visita del Museo, con il medesimo biglietto è possibile proseguire l'itinerario e avere accesso alla chiesa della Collegiata, parte integrante del complesso del Convento degli Agostiniani.
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